1. 紫外消du30min后封閉紫外燈，敞開超凈臺正常作業(yè)狀況，用酒精消du操作者的雙手。
2. 將所需的培育基，胰酶確保瓶身潔凈后放于作業(yè)臺面內(nèi)，點燃酒精燈，將培育基和胰酶瓶口用酒精棉球擦洗后，再將瓶口對準在酒精燈上消du2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消du瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培育基瓶放于斜架上，瓶口對準酒精燈，且放在間隔酒精燈zui近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。
3. 將培育瓶瓶口在酒精燈上消du2-3次，旋開后分別再次消du瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培育瓶內(nèi)的培育液懸空倒進污缸，在酒精燈消du2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消du1-2次，然后再裝上槍頭汲取1.5ml胰酶液，懸空移入培育瓶內(nèi)。
4. 將培育使胰酶浸沒整個瓶壁的細胞層，計時約40s，立馬豎起對著燈火可觀察到細胞與細胞之間有zhen孔樣縫隙，并有1-2個細胞掉落，這時為胰酶消化的zui適時機。若看到成片的細胞從瓶壁掉落為胰酶消化過度；若看不到zhen孔樣縫隙和細胞掉落，則需持續(xù)消化，悄悄的敏捷平放培育瓶使胰酶浸沒細胞層1s后敏捷豎起對著燈火觀察細胞狀況，可反復幾回，直至出現(xiàn)zhen孔樣縫隙和1-2個細胞掉落的消化狀況。用移液器將胰酶吸凈。
5. 汲取1ml細胞凍存液于培育瓶內(nèi)，并用移液器汲取少量的培育基輕柔的反復沖洗培育瓶壁5-8次，使貼壁細胞*掉落于培育基內(nèi)再悄悄吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀況。
6. 將1ml含有細胞的凍存液移入新的保種管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好試驗符號。
7. 將培育基瓶口和瓶蓋消du2-3次后擰緊，平息酒精燈，整理試驗臺面，取出試驗試劑及污缸等，封閉超凈作業(yè)臺。
8. 將保種管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱內(nèi)3-4天，zui后存放于-196℃的液氮灌內(nèi)長時間保存。
注此進程也可簡化因?qū)嶋H操作進程中經(jīng)歷所得：步驟7結(jié)束后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80℃冰箱內(nèi)4-5天，即可放于液氮灌保存。但-80℃冰箱也可保存細胞株2-3月。
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