中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CTLA4 Ig-24)
細(xì)胞介紹
CHO 細(xì)胞以人 CTLA-4 基因細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列和人 IgCgamma1 的絞鏈區(qū)，CH2 和CH#區(qū)序列的融合結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染，構(gòu)建了這株細(xì)胞。它們表達(dá)融合蛋白(CTLA4Ig)。
 
細(xì)胞特性
1）來(lái)源：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢
2）形態(tài) ：可貼壁生長(zhǎng)（上皮細(xì)胞樣），也可懸浮生長(zhǎng)（圓球形）
3）含量：>1x10 6 個(gè)/mL
4）污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性
5）規(guī)格：T25 瓶或者 1mL 凍存管包裝運(yùn)輸和保存：使用含有胎牛血清的 2ml 凍存管發(fā)送存活細(xì)胞。收到細(xì)胞后，可在 1000RPM，常溫條件下，離心 5min 后，于潔凈操作臺(tái)棄去上清，加入推薦使用的培養(yǎng)基后至10cm 培養(yǎng)皿或者 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟。
 
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CTLA4 Ig-24)細(xì)胞用途：僅供使用。
細(xì)胞培養(yǎng)步驟
一． 培養(yǎng)基 及 培養(yǎng) 凍存 條件準(zhǔn)備：
培養(yǎng)條件：貼壁生長(zhǎng)時(shí)，選擇 DMEM-H 培養(yǎng)基(DMEM-H:GIBCO,添加 NaHCO3 1.5g/L, 添加 0.2 mM 脯氨酸,0.001 mM 氨甲蝶呤)，90%；胎牛血清，10%。[MTX 是基因 DHFR 產(chǎn)物的抑制物。當(dāng)培養(yǎng)基中存MTX 時(shí)，MTX 可滲入細(xì)胞內(nèi)與 DHFR 蛋白結(jié)合，使核苷酸的合成受阻。但是 DHFR 基因連同其附近幾千 KB的 DNA 還會(huì)擴(kuò)增以滿(mǎn)足核苷酸合成的需要。理論上 MTX 濃度越大，DHFR 基因擴(kuò)增越多，與 DHFR 基因連鎖的目的蛋白基因也表達(dá)得越多]懸浮培養(yǎng)時(shí)，請(qǐng)使用懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為：EX-CELL CD-CHO CHOSerum-free Medium,Chemically Defined(Sigma-Aldrich)添加物：L- 谷氨酰胺（Sigma-Aldrich）Anti-Clumping Agent(Gibco)備注 ：CD-CHO CHO Serum-free Medium 請(qǐng)按照培養(yǎng)基配制說(shuō)明書(shū)配制，L-谷氨酰胺配制濃度為 200mM，工作濃度為 8mM（即稀釋 25 倍，如 500ml CHOSerumfreeMedium中添加 20ml 200mM L-谷氨酰胺，抗結(jié)團(tuán)劑使用為 1%，即 500ml CHOSerum-free Medium 中添加 5ml 抗結(jié)團(tuán)劑）
1）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為 70%-80%。
2）凍存液：90%*培養(yǎng)基（貼壁生長(zhǎng)凍存時(shí)）或 90%懸浮培養(yǎng)基（懸浮生時(shí)），10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
二． 細(xì)胞 處理 ：
1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入 4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。
2. 加 2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 到 1：5 的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按 1：2 到 1：5 的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按 1：2 到 1：3 的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約 1ml 含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加 10%DMSO 后進(jìn)行凍存。懸浮細(xì)胞凍存時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞收集，1000RPM 條件下離心 4 分鐘，少量保存上清液（防止細(xì)胞吸走），加入部分新鮮培養(yǎng)基，加入到凍存管中，在凍存管中加入 10%DMSO 后進(jìn)行凍存。
 
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CTLA4 Ig-24)注意事項(xiàng)：
1. 收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們電聯(lián)。
2. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。